Les exemples d'application de cytométrie de flux

Cell Cycle
Révélation des molécules intracellulaires
Analyse de l'expression de GFP

La quantité d’ADN par cellule varie au cours du cycle cellulaire ( CC ).
L'ADN est capable de lier une sonde fluorescente d'une façon stoechiométrique permettant ainsi
une mesure du contenu en ADN de chaque cellule
qui rend possible l'étude de la distribution des cellules dans les différentes phases du CC

 

Image classique représentant la distribution des cellules dans les différentes phases du CC. La majorité des cellules est en G0/G1, car c’est l’étape la plus longue. Elles forment ainsi un pic bien distinct (diploïdie).

Les cellules en phase S ont une quantité variable d’ADN, ce qui explique leur distribution étalée. En phases G2 et M, les cellules sont tétraploïdes, ce qui se traduit par une formation d’un second pic au double de la valeur de G1.

Les cellules "en générale" donnent une distribution G0-G1/ S / G2-M autour de 60 / 20 / 20 %. Il est facile en cytométrie de produire une image du CC, qui rassemble (sic!) à l'illustration ci-haut, mais il est parfois difficile d'obtenir une bonne image qui permet une analyse fiable.

Le choi du bon protocole est donc une étape critique pour les travaux sur le cycle cellulaire. Nous pouvons proposer quelques protocoles "faits maison" qui consistent en de légères modifications de protocoles connus et largement publiés.

Un protocole simple et efficace

Un protocole simple, efficace et rapide
Une extension au premier protocole, permettant l’analyse simultanée des antigènes cellulaires

Lors de l'étude du cycle cellulaire, on a souvent la nécessité de suivre également l'expression d'une protéine intra- ou extracellulaire. Le protocole Cell Cycle 02 permet de le faire, mais la fixation à l'alcool, restant un moyen de choix pour le marquage d'ADN, rend souvent très difficile la révélation des antigènes cellulaires par des anticorps.

Contrairement aux alcools, les aldéhydes, tout en préservant le "paysage" antigénique d'une cellule, rendent l'ADN nucléaire difficilement accessible par les colorants fluorescents (ex. fig. "A" ci haut) [Rousselle et al]

La procédure de décondensation de la chromatine [Vinogradov et al] préalable à la fixation par les aldéhydes permet de jumeler les avantages des deux approches:

Sans la fixation (idéal pour détecter la dégradation d'ADN, p.ex lors de l'apoptose)

Avec la fixation

Une fois que votre protocole est bien établi et permet d'obtenir un histogramme du CC d'une qualité acceptable, vous devez utiliser un algorithme particulier basé sur un modèle mathématique du CC [Baisch et al] afin d'estimer (et non déterminer !) le nombre de cellules dans chacune des phases. C'est à dire traduire l'histogramme "brut" de gauche en un résultat publiable de droite.

Actuellement, nous utilisons un programme ModFit pour effectuer l'analyse de CC. (mode d'emploi en bref)

Pour plus de détails lisez:

Pozarowski P, Darzynkiewicz Z. Analysis of cell cycle by flow cytometry .
Methods Mol Biol. 2004;281:301-1

Nunez R. DNA measurement and cell cycle analysis by flow cytometry
Curr Issues Mol Biol. 2001 Jul;3(3):67-70.

Riccardi C, Nicoletti I. Analysis of apoptosis by propidium iodide staining and flow cytometry. Nat Protoc. 2006; 1: 1458-61

La mesure de la quantité d'ADN est une très bonne méthode pour explorer le  CC, mais il est difficile, voire impossible, de procéder à l'analyse de CC si la répartition des cellules dans le  CC est loin du modèle présenté à la Fig. 1. Par exemple, si on travaille avec des cellules synchronisées; traitées par un inhibiteur d'une phase de  CC, etc. l'algorithme d'analyse risque de ne pas convenir dans ces situations [Buchegger et al]

Afin de déterminer avec exactitude le pourcentage de cellules en phase S du CC on incorpore dans l'ADN nouvellement synthétisé du brome-dezoxy-uridine (BrdU) à la place de la thymidine. Par la suite, on quantifie le BrdU à l'aide d'anticorps fluorescents. L'exploration des plus exhaustives du CC consiste à jumeler les deux approches.

Terry NH, White RA.
Flow cytometry after bromodeoxyuridine labeling to measure S and G2+M phase durations plus doubling times in vitro and in vivo.
Nat Protoc. 2006;1(2):859-69.

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